Οι γονιδιωματικές αλληλουχίες των περισσότερων ιών είναι γνωστές.Ανιχνευτές νουκλεϊκού οξέος που είναι μικρά τμήματα DNA σχεδιασμένα να υβριδοποιούνται με συμπληρωματικά ιικά τμήματα DNA ή RNA.Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια πιο αποτελεσματική τεχνική για την ανίχνευση ιών.Πρόσφατα αναπτύχθηκαν διαγνωστικές μέθοδοι υψηλής απόδοσης.
Α. Τεχνική υβριδισμού νουκλεϊκού οξέος
Ο υβριδισμός νουκλεϊκού οξέος, συμπεριλαμβανομένου κυρίως του Southern blotting (Southern) και του Northern blotting (Northern), είναι μια ταχέως αναπτυσσόμενη νέα τεχνική στο διαγνωστικό πεδίο του ιού.Το σκεπτικό της δοκιμασίας υβριδισμού είναι η χρήση βραχέων τμημάτων DNA (που ονομάζονται «ανιχνευτής») σχεδιασμένα να υβριδοποιούνται με συμπληρωματικά ιικά τμήματα DNA ή RNA.Με θέρμανση ή αλκαλική επεξεργασία, το δίκλωνο DNA ή RNA στόχος διαχωρίζονται σε μονούς κλώνους και στη συνέχεια ακινητοποιούνται σε στερεό στήριγμα.Μετά από αυτό, προστίθεται ανιχνευτής και υβριδοποιείται με το DNA ή το RNA στόχο.Καθώς ο ανιχνευτής είναι επισημασμένος με ισότοπο ή μη ραδιενεργό νουκλίδιο, το DNA ή το RNA στόχος μπορεί να ανιχνευθεί μέσω αυτοραδιογραφίας ή μέσω του συστήματος βιοτίνης-αβιδίνης.Δεδομένου ότι τα περισσότερα ιικά γονιδιώματα έχουν κλωνοποιηθεί και προσδιοριστεί η αλληλουχία τους, μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας ειδικές για τον ιό αλληλουχίες ως ανιχνευτές στο δείγμα.Επί του παρόντος, οι μέθοδοι υβριδισμού περιλαμβάνουν: κηλίδα κουκκίδας, in situ υβριδισμό σε κύτταρα, στύπωμα DNA (DNA) (αποτύπωση Southern) και στύπωμα RNA (RNA) (κηλίδα Northern).
Τεχνολογία B.PCR
Τα τελευταία χρόνια, μια σειρά τεχνικών ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων in vitro έχει αναπτυχθεί με βάση την PCR, για τον έλεγχο μη ευαίσθητων ή μη καλλιεργήσιμων ιών.Η PCR είναι μια μέθοδος που μπορεί να συνθέσει συγκεκριμένη αλληλουχία DNA με αντίδραση in vitro πολυμεράσης.Η διαδικασία της PCR περιλαμβάνει έναν θερμικό κύκλο τριών σταδίων: μετουσίωση, ανόπτηση και επέκταση Σε υψηλή θερμοκρασία (93℃~95℃), το δίκλωνο DNA διαχωρίζεται σε δύο μονούς κλώνους DNA.Στη συνέχεια, σε χαμηλή θερμοκρασία (37℃~60℃), δύο συντιθέμενοι εκκινητές νουκλεοτιδίου ανόπτονται στα συμπληρωματικά τμήματα DNA.ενώ στην κατάλληλη θερμοκρασία για το ένζυμο Taq (72℃), η σύνθεση νέων αλυσίδων DNA ξεκινά από το 3' άκρο του εκκινητή χρησιμοποιώντας συμπληρωματικό DNA ως εκμαγεία και μεμονωμένα νουκλεοτίδια ως υλικά.Έτσι, μετά από κάθε κύκλο, μια αλυσίδα DNA μπορεί να ενισχυθεί σε δύο αλυσίδες.Επαναλαμβάνοντας αυτή τη διαδικασία, κάθε αλυσίδα DNA που συντίθεται σε έναν κύκλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο στον επόμενο κύκλο και ο αριθμός των αλυσίδων DNA διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο, πράγμα που σημαίνει ότι η παραγωγή PCR ενισχύεται με ταχύτητα 2n log.Μετά από 25 έως 30 κύκλους, η παραγωγή PCR αναγνωρίζεται μέσω ηλεκτροφόρησης και τα συγκεκριμένα προϊόντα DNA μπορούν να παρατηρηθούν υπό υπεριώδες φως (254 nm).Για το πλεονέκτημα της ειδικότητας, της ευαισθησίας και της ευκολίας της, η PCR έχει υιοθετηθεί στην κλινική διάγνωση πολλών ιογενών λοιμώξεων όπως ο HCV, ο HIV, ο CMV και ο HPV.Καθώς η PCR είναι πολύ ευαίσθητη, μπορεί να ανιχνεύσει το DNA του ιού σε επίπεδο fg, η επέμβαση θα πρέπει να γίνει πολύ προσεκτικά για να αποφευχθούν ψευδώς θετικά.Επιπλέον, το θετικό αποτέλεσμα στη δοκιμή νουκλεϊκού οξέος δεν σημαίνει ότι υπάρχει ζωντανός μολυσματικός ιός στο δείγμα.
Με την ευρεία εφαρμογή της τεχνικής PCR, νέες τεχνικές και μέθοδοι αναπτύσσονται με βάση την τεχνική PCR για διαφορετικούς σκοπούς δοκιμής.Για παράδειγμα, η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο μπορεί να ανιχνεύσει ιικό φορτίο.Η in situ PCR χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό μόλυνσης από ιό σε ιστούς ή κύτταρα.Η ένθετη PCR μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα της PCR.Μεταξύ αυτών, η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο έχει αναπτυχθεί ταχύτερα.Πολλές νέες τεχνικές, όπως ο ανιχνευτής υδρόλυσης TaqMan, ο ανιχνευτής υβριδοποίησης και ο ανιχνευτής μοριακού φάρου, έχουν συνδυαστεί στην τεχνική ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική έρευνα.Εκτός από τον ακριβή προσδιορισμό του ιικού φορτίου στο σωματικό υγρό των ασθενών, αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση μεταλλαγμένου ανεκτικού στα φάρμακα.Ως εκ τούτου, η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο εφαρμόζεται κυρίως στην αξιολόγηση θεραπευτικών αποτελεσμάτων και στην επιτήρηση ανοχής στα φάρμακα.
Γ. Ανίχνευση υψηλής απόδοσης ιικών νουκλεϊκών οξέων
Για να καλυφθούν οι ανάγκες για γρήγορη διάγνωση νέων αναδυόμενων μολυσματικών ασθενειών, έχουν καθιερωθεί διάφορες μέθοδοι ανίχνευσης υψηλής απόδοσης, όπως τα τσιπ DNA (DNA).Για τα τσιπ DNA, συντίθενται ειδικοί ανιχνευτές και συνδέονται με μικρά τσιπ πυριτίου σε πολύ υψηλή πυκνότητα για να σχηματίσουν μικροσυστοιχία ανιχνευτών DNA (DNA) που μπορεί να υβριδοποιηθεί με δείγμα.Το σήμα του υβριδισμού μπορεί να απεικονιστεί με ομοεστιακό μικροσκόπιο ή σαρωτή λέιζερ και να υποβληθεί σε περαιτέρω επεξεργασία από τον υπολογιστή και να ληφθεί τεράστιο σύνολο δεδομένων σχετικά με διαφορετικά γονίδια.Υπάρχουν δύο είδη τσιπ DNA.Το «τσιπ σύνθεσης» έχει ως εξής: τα συγκεκριμένα ολιγονουκλεοτίδια συντίθενται απευθείας στα τσιπ.Ένα άλλο είναι το τσιπ δεξαμενής DNA.Τα κλωνοποιημένα γονίδια ή τα προϊόντα PCR τυπώνονται με τάξη στη διαφάνεια.Το πλεονέκτημα της τεχνολογίας τσιπ DNA είναι η ταυτόχρονη ανίχνευση μιας τεράστιας ποσότητας αλληλουχιών DNA.Η τελευταία έκδοση του τσιπ ανίχνευσης παθογόνων μπορεί να αναγνωρίσει πάνω από 1700 ανθρώπινους ιούς ταυτόχρονα.Η τεχνολογία τσιπ DNA έλυσε τα προβλήματα των παραδοσιακών μεθόδων υβριδισμού νουκλεϊκών οξέων και έχει πολύ ευρείες εφαρμογές στη διάγνωση ιών και στην επιδημιολογική μελέτη.
Ώρα δημοσίευσης: Δεκ-23-2020